8 hybridizing a set of decoder probes with a subsequence of the detection reagents, wherein each subpopulation of said decoder probes comprises an optical detectable label, each optical detectable label generating an optical signal signature corresponding to each subsequence;

9 detecting said optical signal signature produced upon the hybridization of said set of decoder probes and obtaining an image;

18 Hybridisieren eines Satzes von Decodersonden mit einer Teilsequenz der Nachweisreagenzien, wobei jede Teilpopulation der Decodersonden eine optisch nachweisbare Markierung umfasst, wobei jede optisch nachweisbare Markierung eine optische Signalsignatur generiert, die jeder Teilsequenz entspricht;

19 Nachweisen der optischen Signalsignatur, die bei der Hybridisierung des Satzes von Decodersonden produziert wurde, und Erhalten eines Bildes;

Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Nachweisreagenzien umfasst, wobei

69 each subpopulation of the detection reagents targets at least one different analyte, wherein

Entfernen jeglicher ungebundener Nachweisreagenzien;

Nachweisen der Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen des Nachweisreagenzes in einer zeitlich aufeinander folgenden Weise, wobei

89 said detection of the subsequences comprises:

Vergleichen der zeitlichen Reihenfolge der optischen Signalsignaturen mit unterschiedlichen Identifikatoren des mindestens einen Sondenreagenzes,

107 wherein an agreement between the temporal order of the optical signal signatures and a particular identifier of said at least one probe reagent identifies the analyte in the sample.

112 Gemäß Merkmal 2.4.2 weist das patentgemäße Nachweisreagenz neben einem Sondenreagenz auch eine Nukleinsäuremarkierung auf, die wiederum eine "Vielzahl" ("plurality") von vorbestimmten Teilsequenzen umfasst. Im Absatz [0112] gibt das Streitpatent zwar an, dass der Begriff "Vielzahl" jede beliebige Anzahl von 1 bis 100 umfassen und damit auch für eine einzige Teilsequenz stehen kann. Davon, dass die Nukleinsäuremarkierung nur aus einer einzigen Teilsequenz besteht, geht der zuvor definierte Fachmann aber nicht aus. Zum einen weist das Streitpatent in Figur 13 zur graphischen Erläuterung der patentgemäßen Lehre bereits auf eine Nukleinsäuremarkierung mit drei Teilsequenzen hin. Zum anderen ist mit einer einzigen Teilsequenz das Merkmal 4.1.4 nicht realisierbar. Dieses fordert eine Wiederholung der in den Merkmalen 4.1.1 bis 4.1.3 vorgesehenen Verfahrensschritte betreffend das Hybridisieren (Merkmale 4.1.1 und 4.1.1.1.), das Detektieren (Merkmal 4.1.2) sowie das Dehybridisieren (Merkmal 4.1.3) von Decodersonden in Verbindung mit einer anderen Teilsequenz. Eine solche Wiederholung setzt somit das Vorliegen von mindestens zwei Teilsequenzen voraus. Außerdem wäre der Begriff Teilsequenz im Merkmal 2.4.2 bedeutungslos, wenn die Nukleinsäuremarkierung nur aus einer einzigen Nukleinsäuresequenz bestehen würde. Dafür, dass der im Merkmal 2.4.2 verwendete Begriff "Vielzahl" für mindestens zwei Teilsequenzen steht, spricht letztendlich auch die Verwendung dieses Begriffs im allgemeinen Sprachgebrauch, in dem der Begriff "Vielzahl" immer dann verwendet wird, wenn das Gegenteil von Einzahl ausgedrückt werden soll, ohne einen bestimmten Zahlenwert anzugeben. Angaben dazu, dass das Streitpatent bei dem Begriff "Vielzahl" vom allgemeinen Sprachgebrauch abweicht, finden sich im Streitpatent nicht.

113 Unter einer "Probe" ("sample"), wie sie in den patentgemäßen Merkmalen 1 und 2 genannt wird, versteht der Fachmann aufgrund der Angaben im Absatz [0008] des Streitpatents u.a. eine Protein-haltige "Probe", die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aber auch eine "Probe", die eine oder mehrere Zellen, ein oder mehrere Gewebe und/oder eine bzw. mehrere Flüssigkeiten enthält. Derartige biologische "Proben" müssen nicht, können aber nach der Definition des Streitpatents mechanisch aufbereitet (vgl. NK3, Abs. [0049 und 0050]), aber auch chemisch und/ oder biologisch behandelt werden (vgl. NK3, Abs. [0218 und 0219]). Eine solche Probenverarbeitung im patentgemäßen Sinn dient u.a. dem Schutz und/oder der Stabilisierung der Zielanalyten ("target analytes"), oder aber deren Freisetzung aus anderen Bestandteilen der "Probe" (vgl. NK3, Abs. [0219]). Denn soll, wie beim patentgemäßen Verfahren, eine Vielzahl von Analyten spezifisch bestimmt werden, erfordert dies den direkten Kontakt der Analyten mit den Nachweisreagenzien. Der direkte Kontakt der Nachweisreagenzien mit der nativen "Probe", die keiner Probenverarbeitung unterzogen worden ist, ist dagegen aus zweierlei Gründen nicht sinnvoll: Einerseits soll nicht die "Probe" per se nachgewiesen werden, sondern die in ihr enthaltenen Analyten, und zweitens sind Analyten in der nativen "Probe" ohne vorherige Probenverarbeitung für die Nachweisreagenzien oftmals nicht zugänglich, weshalb z.B. regelmäßig Zellaufschlüsse durchgeführt werden müssen, um Analyten in Form von Chromosomen, mRNA oder intrazellulär vorhandenen Proteinkomplexen nachweisen zu können. Demzufolge wird der Begriff "Probe" im Streitpatent als Überbegriff für alle darin enthaltenen Analyten verwendet.

114 Der Auffassung der Beklagten, dass das im Merkmal 2 vorgesehene Kontaktieren der "Probe" mit einer Vielzahl von Nachweisreagenzien etwas anderes sei als das Kontaktieren mit den Analyten, kann daher nicht gefolgt werden.

115 Das Argument der Beklagten, dass das Streitpatent gezielt zwischen Zell- und Gewebeproben mit und ohne strukturelle und morphologische Kontextinformationen in Absatz [0214] unterscheide und Analyt und "Probe" deshalb nicht identisch sein könnten, ändert daran nichts. Denn – wie bereits zuvor ausgeführt – bezeichnet das Streitpatent eine "Probe" auch nach einer chemischen und/oder biologischen Behandlung, bei der u.a. die Zielanalyten freigesetzt werden, weiterhin als biologische "Probe" (vgl. NK3, Abs. [0219]). Daraus folgt, dass für die patentgemäße Lehre nicht der stoffliche Zustand der "Probe" von Bedeutung ist, sondern vielmehr der Umstand, dass die "Probe" die Vielzahl an nachzuweisenden Analyten umfasst, so dass die Analyten sowohl in einer künstlichen Umgebung für einen in vitro Nachweis als auch in ihrem nativen Kontext für einen in situ Nachweis vorliegen können.

116 Entgegen der Auffassung der Beklagten, dass die Zugabe der Nachweisreagenzien im patentgemäßen Verfahren aufgrund der Angaben in den Merkmalen 2, 3 und 4.1.3 nur einmalig erfolge, schließt das Streitpatent nicht aus, dass die Nachweisreagenzien während des Verfahrens wieder entfernt und die gleichen Nachweisreagenzien vor einer weiteren Detektionsrunde erneut zugegeben werden können.

117 Eine dauerhafte Verbindung zwischen Analyten und Nachweisreagenzien ist dem Streitpatent an keiner Stelle zu entnehmen. Aus dem erteilten Patentanspruch 1 geht lediglich vor, dass nach dem Entfernen der optischen Signalsignaturen (Merkmal 4.1.3) im nachfolgenden Merkmal 4.1.4 die Schritte (i) bis (iii) der Merkmale 4.1.1 bis 4.1.3 betreffend die Hybridisierung, Detektierung und Dehybridisierung von Decodersonden, wiederholt werden. Eine gleichzeitige, erneute Zugabe der im Merkmal 2 genannten Nachweisreagenzien wird an dieser Stelle nicht erwähnt. Sie wird aber auch nicht ausgeschlossen. Dafür, dass eine erneute Zugabe der Nachweisreagenzien möglich ist, spricht die Tatsache, dass durch den im Merkmal 1 genannten Begriff "umfassend" ("comprising") das patentgemäße Verfahren außer den in den Merkmalen 2 bis 5.1 genannten Schritten noch weitere Schritte aufweisen kann, was durch die Angaben im Absatz [0278] der Beschreibung des Streitpatents bestätigt wird.

118 Die Beklagte ist demgegenüber der Auffassung, dass sich der erste Schritt des Entfernens im Merkmal 3 nur auf ungebundene Nachweisreagenzien beziehe und der zweite Schritt des Entfernens im Merkmal 4.1.3 nur die Entfernung der optischen Signalsignaturen betreffe, so dass der erteilte Patentanspruch 1 an keiner Stelle eine Entfernung von Nachweisreagenzien vorsehe, die bereits spezifisch an Zielanalyten gebunden seien. Dies werde aus der Sicht der Beklagten auch durch die Beschreibung des Streitpatents bestätigt, in der selbst in dem mit Nachweisreagenzien befassten Absatz [0052] nicht von einer Entfernung der Nachweisreagenzien die Rede sei. Hinzu komme, dass ein zwischenzeitliches Entfernen der Nachweisreagenzien keinen Vorteil biete, da – wie in Absatz [0046] des Streitpatents angegeben – die Kontaktzeit für eine spezifische Bindung zwischen Analyten und Nachweisreagenzien mitunter bis zu 48 Stunden betragen könne.

119 Diese Betrachtung vermag eine eingeschränkte Interpretation des Wortlauts von Patentanspruch 1 nach Hauptantrag dahingehend, dass dieser ein zwischenzeitliches Entfernen der Nachweisreagenzien ausschließt, nicht zu stützen. Denn zu dem bereits zuvor angesprochenen, im Merkmal 1 enthaltenen Begriff "umfassend" ("comprising"), der eine Limitierung des erteilten Patentanspruchs 1 auf die darin genannten Verfahrensschritte ausschließt, kommt ein weiterer Aspekt hinzu, der für eine breite Auslegung spricht. Das im Merkmal 4.1.3 genannte "Entfernen der optischen Signalsignatur" kann den Angaben im Absatz [0074] des Streitpatents zufolge durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Daraus ergibt sich, dass hierfür auch Bedingungen gewählt werden können, welche dazu geeignet sind, die Bindung zwischen Nachweisreagenz und Analyt wieder aufzuheben. Immerhin erfordert Merkmal 4.1.3 Bedingungen, die dazu geeignet sind, die gesamte optische Signalsignatur zu entfernen, also nicht nur die optisch nachweisbare Markierung oder die Decodersonde per se, sondern das komplette Konstrukt aus Markierung und Decodersonde. Dabei kann aus fachlicher Sicht nicht nur die Bindung zwischen Decodersonde und Teilsequenz der Nukleinsäuremarkierung zerstört werden, sondern auch die ebenfalls auf einer klassischen Hybridisierungsreaktion basierende Verbindung zwischen Sondenreagenz und Analyt. Wird diese Verbindung zerstört, müssen vor einer weiteren Detektionsrunde die gleichen Nachweisreagenzien wie zuvor (siehe Merkmale 2 und 2.1) erneut zugegeben werden. Die von der Beklagten angesprochenen Inkubationszeiten ändern daran nichts, da diese den Angaben in der Beschreibung des Streitpatents zufolge beliebig lang sein können und mit diesen demzufolge keinerlei Beschränkung in Verbindung gebracht werden kann (vgl. NK3, Abs. [0046]). Es bleibt somit dabei, dass das Streitpatent eine wiederholte Zugabe von Nachweisreagenzien nicht ausschließt.

120 Das Streitpatent selbst enthält keine Definition für den Begriff "in situ". Demzufolge versteht der Fachmann den Begriff im fachüblichen Sinn. Wie dem Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology NK35 im Zusammenhang mit einer in situ durchgeführten Fluoreszenz-Hybridisierung (kurz FISH) zu entnehmen ist, findet die Reaktion dabei im nativen Kontext und somit im strukturellen Umfeld der Zelle statt. Mit dem Begriff in situ wird in der Fachwelt folglich eine Analyse umschrieben, die am natürlichen Ort des Analyten erfolgt und nicht in künstlicher Umgebung wie bei einer in vitro Analyse üblich. Daraus ergibt sich allerdings nicht, dass sich der Analyt zwingend innerhalb einer Zelle befinden muss. Er kann vielmehr auch extrazellulär verortet sein, da das Streitpatent u.a. auch Zelllysate als geeignete biologische Proben erachtet (vgl. NK3, Abs. [0214], Z. 3).

121 Merkmal 4.1.4 sagt aus, dass die Hybridisierung, Dekodierung und Dehybridisierung von Decodersonden an mehreren Teilsequenzen der Nachweisreagenzien wiederholt und somit für jeden Analyten eine zeitliche Reihenfolge optischer Signalsignaturen produziert werden soll. Die Reihenfolge optischer Signalsignaturen wird gemäß Merkmal 5 schließlich zur spezifischen Identifikation eines einzelnen Analyten herangezogen. Damit ist aus technischer Sicht die Zuordnung einer einzelnen optischen Signalsignatur, d.h. einer einzigen optisch nachweisbaren Markierung, zu einem Analyten ausgeschlossen. Eine solche Auslegung der Merkmale 4.1.4 und 5 wird durch Absatz [0044] des Streitpatents gestützt.

122 Nachdem die patentgemäße Lehre somit ein mehrfarbiges, iterativ durchgeführtes Nachweisverfahren betrifft, geht der Fachmann davon aus, dass auch alle in einer Nukleinsäuremarkierung vorhandenen Teilsequenzen nachzuweisen sind (siehe Merkmal 2.4.2) und demzufolge der Nachweis einer einzigen Nukleinsäuremarkierung pro Analyt keinesfalls ausreichend ist. Das Streitpatent sieht in diesem Zusammenhang lediglich vor, dass der Nachweis einer Teilsequenz nicht zwingend ein Farbsignal erfordert, sondern auch "keine Farbe" (= schwarz) bzw. "kein Signal" eine Signalsignatur im patentgemäßen Sinn sein kann, wobei ausgeschlossen wird, dass alle Auslesezyklen dunkel sind (vgl. NK3, Abs. [0113 und 0114]). Daraus ergibt sich für den Fachmann, dass die zeitliche Reihenfolge der optischen Signalsignaturen für jeden Analyten aus mindestens zwei Signalen bestehen muss, wobei aber nicht alle Signale farbig sein müssen.

123 Den Begriff "Sondenreagenz" ("probe reagent") wird der Fachmann nicht mit dem Begriff "Analyt" gleichsetzen.

124 Für den Begriff "Analyt" ("analyte") findet sich in den Absätzen [0210 und 0212] des Streitpatents eine sehr breite, aber dennoch deutliche Definition. Demnach ist ein "Analyt" – auch bezeichnet als "target analyte" oder "target molecule" – dasjenige Molekül, welches durch Bindung des Nachweisreagenzes nachgewiesen, identifiziert oder gemessen werden soll, wobei der "Analyt" Teil einer Probe oder die einzige bzw. wichtigste Komponente der Probe ist. Demzufolge wird der "Analyt" durch das "Sondenreagenz", welches wiederum Teil des Nachweisreagenzes ist, erkannt und geht mit diesem eine Verbindung ein. In Anbetracht dessen können die Begriffe "Analyt" und "Sondenreagenz" nicht als Synonyme erachtet werden, da mit ihnen zwei unterschiedliche Moleküle beschrieben werden.

137 Die Beklagte geht davon aus, dass die NK12 keine Hinweise für die in den Merkmalen 2 und 2.2 genannten Verfahrensschritte liefere. Bei deren Berücksichtigung müsste aus der Sicht der Beklagten in der NK12 nämlich die genomische DNA mit den "sandwich probes" in Kontakt gebracht (Merkmal 2) und die genomische DNA auf einem festen Träger fixiert werden (Merkmal 2.2). Dies sei jedoch nicht der Fall, da in NK12 in diesen Schritten an Stelle der genomischen DNA die ASMs und damit keine "Probe" im patentgemäßen Sinn verwendet werde.

138 Dem kann aufgrund der zuvor unter Punkt B.I.4.2 festgestellten Bedeutung des patentgemäßen Begriffs "Probe" nicht gefolgt werden. Demnach kann die "Probe" aufbereitet und chemisch/biologisch behandelt werden, was dazu führt, dass der patentgemäße Begriff "Probe" als Sammelbegriff für alle darin enthaltenen, nachzuweisenden Analyten steht, und zwar unabhängig davon, ob deren Nachweis in vitro oder in situ durchgeführt wird. Die Merkmale 2 und 2.2 fordern demzufolge nicht, dass die räumlichen Informationen vollumfänglich in einer "Probe" erhalten bleiben müssen, sondern umfassen auch Probenverarbeitungsschritte wie in NK12 und lassen daher eine Aufhebung der räumlichen Strukturen in einer "Probe" zu. Die Merkmale 2 und 2.2 sind mithin so weit gefasst, dass sie sich von der in NK12 vermittelten technischen Lehre nicht abgrenzen; sie beinhalten daher auch keine erfinderische Tätigkeit.

139 Die Beklagte beanstandet ferner, dass in NK12 keine Anregung dafür zu finden sei, die 5`-Region (Sondenreagenz) der "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) so zu konzipieren, dass sie an spezifische Bereiche der genomischen DNA hybridisiere.

140 Auch dieses Argument vermag nicht zu überzeugen, da es sich bei den ASMs um spezifische Bereiche der genomischen DNA handelt (siehe Punkt B.II.1 Abs. 2) und die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) in ihrer 5´-Region (Sondenreagenz) jeweils so gestaltet sind, dass diese eine Hybridisierung mit einem spezifischen ASM eingehen können (vgl. NK12, S. 5, li. Sp., Satz in Zeilen 5 bis 7 i.V.m. Fig. 3B mit dazugehöriger Legende). Somit erfordert auch die Einhaltung von Merkmal 2.4.1 keine über die in NK12 enthaltenen Informationen hinausgehenden Erkenntnisse, die mit einer erfinderischen Tätigkeit in Verbindung gebracht werden könnten.

141 Seitens der Beklagten wurde des Weiteren vorgetragen, dass das Verfah- ren von Göransson et al. eine Rolling-Circle Amplification (RCA) erfordere, um die vorgesehene Fluoreszenz-basierte Detektion überhaupt durchführen zu können, was einen technischen Unterschied zum patentgemäßen Verfahren darstelle.

142 Die Notwendigkeit einer RCA im Verfahren der NK12 führt nicht zu einem technischen Unterschied, der das Naheliegen des patentgemäßen Verfahrens in Frage zu stellen vermag. Zum einen handelt es sich bei der Durchführung einer RCA um eine in biochemischen Nachweisverfahren fachübliche Methode (vgl. NK55, S. 29, dritter Abs.), die auch im Streitpatent Berücksichtigung findet (vgl. NK3, Abs. [0127]). Zum anderen schließt der erteilte Patentanspruch 1 gemäß Hauptantrag solche zusätzlichen Verfahrensschritte aufgrund der Formulierung von Merkmal 1 als "Verfahren …umfassend" nicht aus (siehe Punkt B.I.4.3, zweiter Abs.). Infolgedessen kann nicht davon ausgegangen werden, dass das patentgemäße Verfahren ohne eine RCA oder eine andere Form der Amplifizierung von Zielmolekülen auskommt und sich daher auf erfinderische Weise vom Verfahren der NK12 unterscheidet.

143 Nach Auffassung der Beklagten forderten die Merkmale 2, 2.1, 2.4.2, 3 sowie die Merkmalsgruppe 4 eine Aufrechterhaltung der Bindung zwischen Nachweisreagenz und Analyt während des gesamten Nachweises der vorbestimmten Teilsequenzen, wofür sich in der NK12 keine Anregung finde.

144 Auch dieses Argument führt zu keiner anderen Einschätzung der Sachlage. Wie schon zuvor unter Punkt B.I.4.3 erläutert, geht es in diesem Zusammenhang nicht darum festzustellen, ob im Streitpatent an einer Stelle eine erneute Zugabe der gleichen Nachweisreagenzien vorgesehen ist, sondern vielmehr darum, ob das Streitpatent eine solche wiederholte Zugabe ausschließt. Ein solcher Ausschluss ist aus den bereits zuvor ausgeführten Gründen aber nicht feststellbar und die Lehre des Streitpatents somit dahingehend zu interpretieren, dass in einem den Merkmalen 2, 2.1 und 3 nachgeschalteten Schritt die gleichen Nachweisreagenzien im patentgemäßen Verfahren erneut zugegeben werden können.

145 Hinzu kommt, dass der Fachmann der in NK12 zitierten Stelle betreffend die "Dehybridization of ASMs" nicht eindeutig entnehmen kann, ob mit dem darin beschriebenen Dehybridisierungsschritt nur die mit den "decoding tags" (Teilsequenz) in der 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung) der "sandwich probes" (Nachweisreagenz) hybridisierten "tag probes" (Decodersonden) entfernt werden, oder sowohl die "tag probes" (Decodersonden) als auch die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien). Da sich hierzu weder im weiteren Text noch in den graphischen Darstellungen der NK12 ergänzende Informationen finden, geht der Fachmann davon aus, dass die genannte Zitatstelle beide Optionen einschließt, also eine Entfernung von "tag probes" (Decodersonden) allein oder i.V.m. den "sandwich probes". Dies führt dazu, dass eine anfängliche und damit einmalige Bindung des Nachweisreagenzes an einen Analyten weder im patentgemäßen Verfahren noch im Verfahren der NK12 vorgeschrieben wird, so dass dem patentgemäßen Verfahren auch unter diesem Gesichtspunkt keine erfinderische Tätigkeit zuerkannt werden kann.

146 Die Beklagte vertritt ferner den Standpunkt, dass für den Fachmann keine Veranlassung dafür bestanden habe, die Lehre von NK12 und NK51 zu kombinieren.

147 Dieser Auffassung kann nicht gefolgt werden. Die Lehre der NK51 geht von derselben Problematik wie das Streitpatent aus, wonach in beiden Fällen für den Nachweis einer Vielzahl von Zielmolekülen in einer biologischen Probe nach wie vor genaue, ausreichend sensitive Multiplex-fähige Detektionsmethoden fehlen (vgl. NK3, Abs. [0006], Z. 41 bis 43; NK51, Abs. [0004 und 0005]). Allein die Tatsache, dass die Lehre der NK51 aus dem Jahr 2009 teilweise ein anderes Konzept verfolgt als die Lehre der NK12 aus dem Jahr 2008, ändert nichts daran, dass beide Druckschriften aus dem gleichen Fachgebiet stammen und es sich bei ihnen somit um Literatur handelt, welche der Fachmann zur Lösung der patentgemäßen Aufgabenstellung heranzieht. Einer speziellen Veranlassung bedarf es hierfür nicht.

151 the solid substrate or support is a chip, a microarray, a blotting membrane or a microscopic slide, and wherein

154 Der Hilfsantrag 1 sieht mithin die Umwandlung des patentgemäßen in vitro Verfahrens in ein in situ-Verfahren vor. Hierfür wurde Merkmal 1 auf immunhistochemische Verfahren und/oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs (kurz FISH)-Verfahren beschränkt. Darauf abgestimmt definiert das neue Merkmal 6 die Probe als biologische Probe aus Zellen und/oder Geweben und mit dem neuen Merkmal 7 werden die darin enthaltenen Analyten auf Proteine, Peptide und Nukleinsäuren in Form von verschiedenen RNAs beschränkt.

155 Allerdings kann auch diese Variante des patentgemäßen Verfahrens nicht auf eine erfinderische Tätigkeit zurückgeführt werden.

156 Dabei ist im rechtlichen Ausgangspunkt darauf hinzuweisen, dass nach der Rechtsprechung des Bundesgerichtshofs, die auch auf den hier zu beurteilenden Fall der Stoffchemie anwendbar ist, eine Veranlassung für den Fachmann zum Rückgriff auf allgemeines Fachwissen nur besteht, wenn es sich bei der heranzuziehenden Maßnahme um ein generelles, für eine Vielzahl von Anwendungsfällen in Betracht zu ziehendes Mittel handelt, das seiner Art nach zum allgemeinen Fachwissen gehört, sich die Nutzung der Funktionalität dieses Mittels in dem zu beurteilenden Zusammenhang als objektiv zweckmäßig darstellt und keine besonderen Umstände feststellbar sind, die eine Anwendung aus fachlicher Sicht als nicht möglich, mit Schwierigkeiten verbunden oder sonst untunlich erscheinen lassen (vgl. BGH, Urteil vom 11. März 2014 - X ZR 139/10, GRUR 2014, 647 Rn. 26 - Farbversorgungssystem; Urteil vom 27. März 2018 - X ZR 59/16, GRUR 2018, 716 Rn. 29 - Kinderbett; Beschluss vom 13. Juli 2020 - X ZR 90/18, GRUR 2020, 1074 Rn. 49 - Signalübertragungssystem; Urteil vom 15. Juni 2021 - X ZR 58/19, GRUR 2021, 1277 Rn. 47 - Führungsschienenanordnung).

157 Übertragen auf den vorliegenden Fall ist diesbezüglich vorab festzuhalten, dass in Fachkreisen neben in vitro durchgeführten Verfahren zum spezifischen und quantitativen Nachweis von Zielmolekülen in einer biologischen Probe, in situ-Verfahren eine besondere Bedeutung zukommt, da mit ihnen zusätzliche Informationen zum nativen Ort der Zielmoleküle in der Probe erhalten werden (vgl. NK35, Stichwort "fluorescence in situ hybridization"). Ein Detektionsverfahren nicht nur in vitro, sondern auch in situ durchführen zu können ist daher ein generelles Ziel und die hierfür notwendigen technischen Maßnahmen hinreichend bekannt (vgl. NK28, S. 223, Abstract und NK34, S. 663, Abstract).

158 Im Zusammenhang mit der Frage nach der erfinderischen Tätigkeit des im Patentanspruch 1 nach Hilfsantrag 1 beschriebenen in situ-Verfahrens erweist sich die NK12 nach wie vor als ein geeigneter Ausgangspunkt, da die technischen Merkmale 2 bis 5.1 im Verfahren des Patentanspruchs 1 nach Hilfsantrag 1 gegenüber dem in vitro Verfahren des erteilten Patentanspruchs 1 gemäß Hauptantrag unverändert geblieben sind.

159 Bei dem von Göransson et al. in NK12 anhand einer genomischen Analyse beschriebenen Multiplex-Verfahren, welches im Array-Format durchgeführt wird, handelt es sich unbestritten um ein in vitro-Verfahren.

160 In NK12 findet der Fachmann darüber hinaus aber auch Hinweise, welche die Möglichkeit in sein Blickfeld rücken, dieses Verfahren als in situ-Verfahren an Zellen und/oder Geweben zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten in Form von mRNA oder Proteinen/Peptiden durchführen zu können. Einen ersten Hinweis hierauf findet der Fachmann im letzten Satz des Abstracts von NK12, der besagt, dass die darin vorgestellte Decodierungsstrategie insofern breit anwendbar ist, als das Zielmolekül hierfür jedes Biomolekül sein kann, welches über eine molekulare Sondenreaktion in zirkuläre DNA überführt werden kann. Im letzten Satz des Abschnitts "Discussion" sprechen die Autoren der NK12 dann gezielt die Analyse der Expression von mRNA und Proteinen an. Bekräftigt wird die Möglichkeit einer in situ-Analyse mit dem Verfahren der NK12 durch den weiteren darin enthaltenen Hinweis, den Göransson et al. mit dem Verweis auf die Literatur-Referenz (33) verbinden. Göransson et al. führen aus, dass die für den Erhalt zirkulärer Nukleinsäuren eingesetzten Padlock Sonden bei der Analyse der "mRNA expression" geeignet sind und Proteine in gleicher Weise mittels sog. "Proximity Ligation Assays" (kurz PLA) nachgewiesen werden können (vgl. NK12, S. 7, li. Sp.). Darauf abgestimmt handelt es sich bei der von ihnen zitierten Literatur-Referenz (33) um den vorliegend als Dokument NK16 bezeichneten wissenschaftlichen Artikel von Söderberg et al., der sich mit der in situ-Untersuchung von endogenen Proteinkomplexen befasst. Diese Arbeitsgruppe führt den von ihnen entwickelten in situ-Nachweis mittels "Proximity Ligation Probes" und RCA durch (vgl. NK16, S. 995, Abstract). Die Anwendung dieser Techniken bei in situ-Verfahren weckt eine angemessene Erfolgserwartung beim Fachmann dafür, dass das Multiplex-Verfahren der NK12, welches die gleichen Techniken anwendet, ebenfalls für eine in situ-Analyse genutzt werden kann.

161 Eine weitere Anregung, die die Erfolgserwartung des Fachmanns stützt, liefert die Druckschrift NK55. In ihrer Doktorarbeit beschreibt Grundberg auf Seite 46, dass sich Padlock-Sonden und Rolling-Circle Amplification in dem von ihr entwickelten Nachweisverfahren als ausgezeichnete Methoden für die in situ-Detektion von Punktmutationen in Onkogenen erwiesen haben (vgl. NK55, S. 46, erster Abs. letzter Satz). Darin erkennt der Fachmann eine Strategie, wie sie auch im in vitro-Multiplex-Verfahren der NK12 Anwendung findet. Daran anschließend stellt sich die Autorin der NK55 die Frage, was im Zusammenhang mit dem von ihr beschriebenen Nachweisverfahren als nächster Schritt unternommen werden soll (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., erster Satz). Eine Anwendungsgrenze für ihr Verfahren sieht Grundberg insbesondere darin, dass es aufgrund der begrenzten Anzahl von verwendbaren Fluorophoren bisher noch nicht als Multiplex-Verfahren eingesetzt werden kann (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., vorletzter Satz). Um dieses Problem zu beseitigen, weist sie in ihrer Doktorarbeit NK55 auf die frühere Studie NK12 von Göransson et al. hin. In dieser ist aus der Sicht von Grundberg unter Verwendung von Padlock-Sonden, sowie einem auf konsekutiven Hybridisierungsschritten basierenden Decodierungsschema der Multiplex-Nachweis einer Vielzahl von Analyten in biologischen Proben bereits gelungen (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., letzter Satz i.V.m. Literatur-Referenz (113)). In Kenntnis dessen hatte der Fachmann eine angemessene Erfolgserwartung dahingehend, dass das in vitro durchgeführte Multiplex-Verfahren der NK12 auch in situ durchführbar ist.

162 Darin wird der Fachmann zudem durch die Druckschriften NK34 und NK36 bestärkt, die belegen, dass ein Multiplex-FISH Verfahren zum Nachweis von RNA in Geweben schon Jahre vor dem Prioritätstag des Streitpatents angewendet worden ist, so dass der Fachmann den in situ-Nachweis von RNA mit keinerlei Schwierigkeiten in Verbindung bringt (vgl. NK34, S. 663, Abstract i.V.m. Figur 1 mit dazugehöriger Legende und NK36, S. 846, li. Sp., dritter Satz). Ihm war vielmehr bewusst, dass er bei der Entwicklung eines Multiplex-RNA-FISH-Assays mit einem sequentiellen Nachweis gemäß NK12 auf diesen etablierten Techniken aufbauen kann.

163 Eine Aufrechterhaltung des Streitpatents mit der Anspruchsfassung des Hilfsan-trags 1 scheidet mangels erfinderischer Tätigkeit daher aus.

164 Die hiergegen von der Beklagten vorgebrachten Einwendungen vermögen nicht zu überzeugen.

165 1.3.1 Der Hinweis der Beklagten, dass für das Verfahren nach Hilfsantrag 1 als Proben nur Zellen oder Gewebe in Frage kämen, die NK12 dagegen aber eine Zusammenstellung von DNA-Molekülen in Form von ASMs lehre und somit weder die Verwendung von Zellen bzw. Geweben als Proben, noch den Nachweis von RNA-Molekülen anrege, steht dem Vorstehenden nicht entgegen.

166 Der von der Beklagten angedeutete Wechsel von den in NK12 verwendeten flüssigen Proben hin zu den festen Zell- und Gewebeproben des Hilfsantrags 1 ist zutreffend, kann aber keine erfinderische Tätigkeit begründen. Denn Göransson et al. erachten ihr Verfahren in Bezug auf die darin verwendbaren Zielmoleküle als "generic” und damit als breit anwendbar (vgl. NK12, S. 1, Abstract). Aufgrund dessen beziehen die Autoren der NK12 außer den von ihnen exemplarisch verwendeten flüssigen Proben mit DNA-Fragmenten in Form von ASMs auch ausdrücklich den uneingeschränkten Nachweis der Expression von mRNA und Proteinen als Zielmoleküle in ihre Überlegungen mit ein (vgl. NK12, Abschnitt "Discussion”, letzter Satz). Dadurch erweitern sie zugleich die Art der in ihrem Verfahren verwendbaren Proben, da der Nachweis von RNA und Proteinen im Stand der Technik bekanntermaßen häufig in situ und damit in Zellen und/Geweben durchgeführt wird (vgl. NK16, Titel und NK34, S. 663, Abstract). Die neu in den Patentanspruch 1 nach Hilfsantrag 1 aufgenommenen Merkmale 6 und 7 gehen folglich nicht auf erfin-derische Tätigkeit zurück.

167 1.3.2 Auch der Auffassung der Beklagten, gegen ein Naheliegen des in situ Verfahrens nach Hilfsantrag 1 spreche ferner, dass der Fachmann zahlreiche Probleme im Zusammenhang mit einem Nachweis von RNA erwartet hätte, kann nicht gefolgt werden.

168 Nachdem der Nachweis von RNA mittels FISH als etabliert anzusehen ist und das patentgemäße Verfahren nach Hilfsantrag 1 keine technischen Schritte umfasst, die etwaige Probleme im Umgang mit RNA beseitigen oder abmildern würden, ist davon auszugehen, das mit der Etablierung der RNA-FISH-Technik Probleme, wie das molecular Crowding, bereits gelöst wurden. Der Umgang mit RNA im Zusammenhang mit einem in situ Verfahren konnte die Erfolgserwartung des Fachmanns daher nicht trüben.

169 1.3.3 Gleiches gilt für den Einwand der Beklagten, dass bei einer Umwandlung des Verfahrens der NK12 auf Zell- und Gewebeproben die nativen Strukturen der Zellen bzw. Gewebe zerstört bzw. beschädigt würden, da diese mit jedem Zyklus aus Hybridisierung und Dehybridisierung immer wieder beeinträchtigt und abgebaut würden.

170 Bereits 1998 und damit Jahre vor dem Zeitrang des Streitpatents war es allerdings einschlägig tätigen Fachleuten gelungen, dieses Problem soweit zu lösen, dass sie z.B. mit fötalen Zellen in zeitlicher Reihenfolge eine FISH-Analyse neunmal durchführen konnten, wobei mindestens drei verschiedene Sonden gleichzeitig eingesetzt und somit theoretisch 24 chromosomale Verände-rungen nachgewiesen werden konnten (vgl. NK45, S. 1181, Summary i.V.m. S. 1182, li Sp., erster Abs., letzter Satz und Fig. 2 mit dazugehöriger Legende sowie S. 1184, re. Sp., letzter Abs.). Zudem sind im Verfahren des Patentanspruchs 1 nach Hilfsantrag 1 keine Maßnahmen vorgesehen, um den Abbau von Zellen und/oder Geweben zu minimieren. Daher ist im Verfahren nach Hilfsantrag 1 nach wie vor keine erfinderische Tätigkeit erkennbar.

171 1.3.4 Auch das weitere Argument der Beklagten, dass Padlock-Sonden, wie sie im Verfahren der NK12 verwendet werden, aus fachlicher Sicht für ein in situ-Verfahren ungeeignet seien, was durch die Druckschriften NK40 und NK41 bestätigt werde, vermag nicht durchzugreifen.

172 Stougaard et al. führen in NK40 zwar aus, dass sich Padlock-Sonden für einen in situ Nachweis von RNA-Molekülen in Gewebe-Schnitten, die als Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettets Gewebe vorliegen, nicht geeignet sind (vgl. NK40, S. 2, re. Sp., Abschnitt "Results and discussion”, erster Abs., Z. 10 ff.). Diese Aussage bezieht sich somit einerseits auf eine ganz spezielle Probenart, was den Fachmann folglich nicht dazu veranlasst die Eignung von Padlock-Sonden für in situ-Verfahren grundsätzlich zu verneinen. Andererseits haben die Autoren der NK40 aufgrund der von ihnen geschilderten Problematik für den Nachweis von nicht polyadenylierten RNA Molekülen ein neues Sondenformat entwickelt, welches in NK40 als "Turtle Probes” bezeichnet wird. Dieses neue Sondenformat haben Stougaard et al. zunächst in einem in vitro-Assay erfolgreich getestet und anschließend in einem in situ-Verfahren ebenfalls mit positivem Ergebnis erprobt (vgl. NK40, S. 1, Abstract – "Results” und "Conclusions” i.V.m. S. 4, li. Sp., letzter Abs., erster Satz und S. 5, re. Sp., erster Satz). Dies liefert dem Fachmann eine Anregung dafür, dass ein in vitro erfolgreich durchgeführtes Verfahren auch auf seine Eignung als in situ-Verfahren getestet werden sollte, selbst wenn hierfür z.B. das Format von Sonden angepasst werden muss.

173 In der Druckschrift NK41 wird die niedrige Effizienz des Detektionsnachweises von etwa 1% für das darin beschriebene, unter Einsatz von Padlock-Sonden und RCA durchgeführte Verfahren nur im Zusammenhang mit dem Nachweis von RNA-Molekülen festgestellt, die in einer einzelnen Zelle jeweils als einzelnes Molekül vorliegen (vgl. NK41, S. 768, spaltenübergreifender Abs.). Das Fehlen einer grundsätzlichen Eignung von Padlock-Sonden und RCA-Technik bei in situ-Nachweisen vermittelt folglich auch dieses Dokument nicht.

174 Hiervon geht der einschlägig tätige Fachmann auch deshalb nicht aus, weil im Stand der Technik, wie NK55, zugleich Belege dafür existieren, dass es sich bei Padlock-Sonden und RCA um exzellente Werkzeuge z.B. für den in situ-Nachweis von Punktmutationen in Onkogenen handelt (vgl. NK55, S. 46, erster Abs., letzter Satz). Im Übrigen setzt eine angemessen Erfolgserwartung keine 100 %ige Garantie dafür voraus, dass eine Umwandlung des in vitro-Verfahrens nach NK12 in ein in situ-Verfahren zum Nachweis von RNA und/oder Proteinen von vornherein optimale Ergebnisse liefert.

175 1.3.5 Der Beklagten kann auch nicht dahingehend gefolgt werden, dass Grundberg in NK55 durch ihre Bezugnahme auf NK12 nicht die Absicht geäußert habe, das Verfahren der NK12 in situ durchzuführen, sondern lediglich das Decodie-rungsschema gemäß NK12 zum Nachweis von Padlock-Sonden in ihrem Genotypisierungs- und Mutationsnachweis-Assay zu verwenden.

176 Nachdem sich Grundberg in NK55 allerdings ausschließlich mit einer in situ-Detektion befasst (vgl. NK55, Deckblatt, Titel), kann die darin geäußerte Überlegung, das Decodierungsschema der NK12 mit dem Detektionsverfahren der NK55 zu kombinieren, nur so verstanden werden, dass Grundberg das Multiplex-Verfahren der NK12 grundsätzlich für eine in situ-Anwendung als geeignet erachtet. Denn immerhin beabsichtigt Grundberg ihre eigenes in situ-Verfahren mit Hilfe des Decodierungsschemas der NK12 erstmals in ein Multiplex-Verfahren überführen zu können (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs.). Eine Kombination von in vitro- und in situ-Techniken kommt für Grundberg daher nicht in Betracht und wird infolgedessen auch an keiner Stelle erwähnt.

177 1.3.6 Schließlich ändert sich auch nichts durch die Ansicht der Beklagten, dass der Fachmann von einer Umstellung des in vitro Verfahrens nach NK12 in ein in situ-Verfahren auch deshalb abgehalten gewesen sei, weil der erste Schritt dieses Verfahrens, betreffend den enzymatischen Verdau der genomischen DNA, zu einem bei in situ-Verfahren nicht akzeptablen Verlust an struktureller Information führe.

178 Selbst wenn zugunsten der Beklagten davon auszugehen ist, dass der Fachmann die Fragmentierung der genomischen DNA im in vitro-Verfahren der NK12 als wesentlich erachtet, versteht es sich für den Fachmann dennoch von selbst, dass bei einem in situ-Nachweis von RNA und/oder Proteinen/Peptiden ein solcher enzyma-tischer Verdau weder erforderlich noch sinnvoll ist. Anders ausgedrückt gehört die Anpassung der Probenverarbeitung/Probenvorbereitung bei einer Umstellung des in vitro-Verfahrens der NK12 auf ein in situ-Verfahren zur Routinetätigkeit des Fachmanns. Sie stellt daher keine technische Hürde dar, welche ihn davon abhalten würde, die zuvor angesprochenen, in NK12 und NK55 enthaltenen Anregungen für eine Umstellung auf ein in situ-Verfahren zum Nachweis von RNA, Proteinen und/oder Peptiden zu realisieren.

immunohistochemistry and/or (ii)

fluorescence in situ hybridization for detecting a plurality of analytes in a sample, comprising:

196 Zu Hilfsantrag 5 gelten die Ausführungen zu den Hilfsanträgen 1 und 4 entsprechend.